AGL1 农杆菌电转感受态细胞

AGL1 Electrocompetent cell 农杆菌电转感受态细胞

产品标签：

AGL1菌株；农杆菌感受态细胞；Rifampicin（Rif） 利福平；Kanamycin（kan）卡那霉素； EHA101；LBA4404；GV3101；植物转基因研究；

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产品描述：

AGL1菌株的染色体背景为C58，RecA，核基因含利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pTiBo542DT-DNA，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。AGL1菌株适用于拟南芥、水稻、杨树等植物的转基因操作。

我司懋康生物提供的AGL1电转感受态细胞经特殊工艺制作，特别适合大质粒的转化。基因型C58 RecA (rif^R/carb^R) Ti pTiBo542DT-DNA Succinamopine，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率>10⁵ cfu/μg DNA。

产品组分：

注意事项

1）   感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2）   整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3）   加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

4）   为确保zui高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5）   转化高浓度的质粒可相应减少zui终涂板用量。

6）   平板上克隆密度过大时，由于营养不足，克隆生长变慢，菌落变小。为获得大菌落，应减少质粒用量。

7）   利福平浓度应≤25μg/ml，过高浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。我司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含50μg/ml卡那霉素，若所用平板含20μg/ml 利福平，则转化效率降低到1/2。

8）   培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但这些筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些筛选抗生素，因Ti质粒丢失的概率极低（基本可以忽略）。

9）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1)        将0.1 cm店击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min，待其沥干水分，正置5min，使乙醇充分挥发干净，立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5min使其充分降温。

2)        取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，达到冰水混合状态时插入冰浴中使其*融化。

3)        往50μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg（体积不大于6μl）质粒DNA，用手管底使其混匀，立即插入冰中。用枪轻轻吹打混匀感受态细胞-质粒之后快速转移到店击杯中，盖上杯盖，空管保留待用【注意：由于感受态转化效率较高，*次使用做预试验确定zui加的质粒用量】。

4)        启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数参考Bio-rad，具体使用请参考电转仪推荐步骤来操作），将店击杯快速放入电转槽中，店击完成快速插入冰中。

5)        加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，于28℃振荡培养2~3h。

6)        6,000rpm离心1min，吸掉600ul上清，之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。【注意：当平板只含转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48h即可；当平板中加入双元载体抗生素的同时，再加入20μg/ml 利福平时，需28℃培养60h；若使用的平板含50μg/ml 利福平，需在28℃培养72-90h。】

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附表2 固体和液体YEB培养基配方

附表3常见农杆菌对抗生素敏感性总表

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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