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潮霉素B Hygromycin B的使用方法总结
   潮霉素B Hygromycin B的使用方法总结

  1. 储存液的配制(50mg/ml)

  称取0.5g 潮霉素B加入10ml无菌去离子水内使其*溶解。先用5ml无菌去离子水预湿润0.22μm针头式过滤器,除尽水。之后使用此滤器过滤潮霉素B溶液,除菌后分装成单次使用的小量(如1ml)放到-20℃冻存,约1年稳定。

  2. 常用筛选浓度

  注意:潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型,培养基,生长条件和细胞代谢率而变化,推荐使用浓度为50-1000μg/mL。对于*次使用的实验体系建议通过建立杀灭曲线(kill curve),即剂量反应性曲线,来确定*筛选浓度。

  一般而言,哺乳动物细胞50-500μg/mL;细菌/植物细胞20-200μg/mL;真菌300-1000μg/mL。

  3. 杀灭曲线的建立

  注意:为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素zui低浓度,可通过建立杀灭曲线(剂量反应曲线)来实现,至少选择5个浓度。

  1) *天:未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上,37℃,CO2培养过夜;注:对于需要更高密度来检测活力的细胞,可增加接种量。

  2) 根据细胞类型,设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定50,100,250,500,750,1000μg/mL。先用去离子水按照1:10的比例将母液稀释到5 mg/ml,然后按照下表稀释到相应浓度的工作液。

  3) 第二天:替换旧的培养基,换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。

  4) 接下来每3-4天更换新的含药物培养基。

  5) 按照固定的周期(如每2天)进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数(通常是7-10天)内能够杀死绝大多数细胞的zui低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。

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